小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）原代培养全流程指南

在干细胞基础研究、组织工程、免疫调控及再生医学领域，小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）是不可或缺的核心实验模型。凭借自我更新、多向分化（成骨、成脂、成软骨）、低免疫原性及免疫调节特性，它成为骨损伤修复、炎症疾病、肿瘤微环境、干细胞机制研究的首选细胞。

今天我们结合标准化实验体系与多年科研服务经验，全方位拆解小鼠BMSCs原代培养难点、针对性解决方案、标准化实验流程、核心培养要点及科研应用场景，帮大家高效规避实验雷区，稳定获取高活性、高纯度原代细胞。

骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是成体干细胞的核心类型之一，广泛存在于骨髓基质中，具备自我更新能力、多向分化潜能、低免疫原性与强大的免疫调节特性，可在体外诱导分化为成骨、成软骨、成脂、神经、内皮等多种功能细胞，是再生医学、组织工程、细胞治疗、疾病模型构建、药物筛选等领域的核心种子细胞。

注册临床试验中使用的各种来源的间充质干细胞。从骨髓中分离的间充质干细胞在临床试验中应用最广泛，其次是从脐带和脂肪中分离的间充质干细胞。还使用来自肌肉、牙齿的间充质干细胞。[1]

✅️自我更新能力：可在体外长期扩增，保持干性；

✅️多向分化潜能：可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞等；

✅️低免疫原性：表面低表达MHC-II类分子，不易被宿主免疫系统排斥；

✅️免疫调节功能：分泌多种细胞因子，抑制T细胞、B细胞活化，调节炎症反应；

✅️归巢能力：可定向迁移至损伤部位，参与组织修复；

BMSC 的代表性光学显微镜图像（比例尺：200 μm）[2]

1. 系统掌握小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）原代分离、培养、纯化的全流程标准化操作，建立稳定可重复的 BMSCs 体外培养体系。

2. 成功分离并获得高活性、高纯度、具备良好增殖能力与多向分化潜能的小鼠原代 BMSCs，为后续的干细胞生物学特性研究、定向分化诱导、组织修复功能验证、细胞治疗药效评价等实验提供合格的种子细胞。

3. 熟练掌握无菌操作技术在干细胞原代培养中的全流程应用，规范实验操作细节，建立完善的无菌防控体系，从源头降低细胞污染风险。

BMSCs原代培养技术的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：

✅️ 组织工程：构建骨、软骨、肌腱等组织工程移植物；

✅️ 细胞治疗：治疗移植物抗宿主病（GVHD）、骨缺损、心肌梗死、脊髓损伤等；

✅️ 再生医学：促进损伤组织的修复与再生；

✅️ 疾病模型：建立遗传性骨病、骨质疏松等疾病的细胞模型；

✅️ 药物筛选：评估药物对MSCs增殖、分化的影响，或利用MSCs筛选治疗药物；

✅️ 基础研究：研究干细胞自我更新、分化调控、衰老等分子机制；

BMSCs原代培养虽然技术路线相对成熟，但在实际操作中仍存在多个关键难点，需要特别注意：

说明：骨髓中BMSCs含量极低（约0.001%-0.01%），获取难度大；

应对策略：优化冲洗方法，充分收集骨髓腔内容物；必要时可进行密度梯度离心富集；

说明：骨髓中混有大量造血细胞、红细胞、破骨细胞等；

应对策略：利用BMSCs贴壁快的特性，早期换液去除悬浮细胞；反复换液纯化；

说明：取材过程易引入细菌、真菌；

应对策略：严格无菌操作；使用含双抗的PBS反复清洗；动物体表充分消毒；

说明：不同小鼠品系、年龄、性别、健康状态影响细胞产量和质量；

应对策略：选用4-6周龄健康小鼠；每个品系/批次单独优化条件；

说明：BMSCs在体外扩增有限，传代过多会失去干性和分化潜能；

应对策略：控制传代次数（一般不超过P5-P6）；及时冻存早期代次细胞；

说明：对血清质量、培养基成分、CO₂浓度、pH等要求高 ；

应对策略：使用优质胎牛血清（建议筛选批次）；定期维护培养箱；

实验材料与试剂准备

✅️实验动物：

BABL/C或其他小鼠，4周龄，雌雄不限，体重 18-22g，符合实验动物伦理要求。

✅️试剂准备：

1. 完全培养基：α-MEM 基础培养基（或 DMEM/F12 基础培养基）+ 10% 特级胎牛血清（FBS）+ 1% 青霉素 - 链霉素双抗溶液；

2. 2% 低血清培养基：α-MEM 基础培养基 + 2% 特级胎牛血清 + 1% 青霉素 - 链霉素双抗溶液；

3. 无菌含双抗 PBS 缓冲液：pH7.2-7.4，含 1% 青霉素 - 链霉素双抗溶液，提前 4℃冷藏备用，用于组织清洗、骨髓腔冲洗；

4. 75% 医用酒精：用于实验动物体表消毒、实验耗材无菌擦拭；

✅️耗材准备：

1. 无菌耗材：15mL 无菌离心管、10cm 无菌细胞培养皿、T25 无菌细胞培养瓶、1mL 无菌注射器、移液枪及无菌枪头、无菌眼科剪、无菌镊子、无菌酒精棉球、无菌烧杯。

2.仪器设备：CO₂ 细胞培养箱（37℃、5% CO₂、饱和湿度）、台式低速离心机、生物安全柜（超净工作台）、倒置相差显微镜。

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1. 小鼠脱颈处死，放入含75%酒精的烧杯浸泡3min；

2. 分离小鼠后肢，移入10cm培养皿中，更换剪刀，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨；

3. 移入新的装有无菌含双抗PBS的培养皿，剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织，用含双抗的PBS溶液清洗三遍；

4. 用眼科剪剪去清洗干净的股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔。放入新的装有完培的培养皿中备用；

5. 移入新的装有完培的培养皿，用注射器以PBS反复冲洗骨髓腔直至骨头发白。 收集骨髓液，过40μM细胞筛；

6. 收集过滤骨髓液，离心（1000 rpm，5分钟），后加入培养基接种于培养瓶中置于37℃，5％ CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养；

7. 24h后去悬浮细胞，接下来的每2-3天换液一次，直到需要传代。