上期我们了解到了细胞迁移与侵袭实验是评价细胞运动能力、肿瘤转移潜能 及细胞趋化特性 的经典核心实验。两类实验对操作细节、实验环境及质控标准要求较高，操作规范性直接影响实验数据的准确性与重复性。
本期，关于实验完整的标准化操作流程、试剂使用规范、实验参数设定、实操关键技巧以及常见问题与注意事项，赛因生物全面细致的拆解与详细说明~
一、实验前需要准备什么？
常见实验材料有：
实验细胞、Matrigel或其他细胞外基质材料（侵袭实验）、Transwell小室、配套孔板、培养基、血清或其他趋化因子、双抗、镊子、染色剂（结晶紫、DAPI）、固定液、PBS、无菌枪头、移液器、培养箱、显微镜、棉签。
二、实验流程
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细胞准备：
选择生长状态稳定、无明显污染、活率良好的细胞进行实验。贴壁细胞消化后收集，离心去除原培养液，并根据实验体系使用适当培养基或 assay medium 重悬。
完成细胞计数后，将细胞调整至预实验确定的接种浓度。不要简单照搬其他文献中的细胞数。不同细胞的大小、迁移能力、增殖速度以及 Transwell 规格不同，最佳接种量可能存在明显差异。如果接种细胞过少，膜下细胞数量可能不足以稳定定量；如果细胞过多，则可能出现细胞拥挤、膜孔饱和甚至细胞堆积，使不同组之间的真实差异被掩盖。
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细胞迁移实验
以直径 6.5 mm Transwell小室为例
1. 将 Transwell insert 放入配套培养板。向上室加入预定数量的细胞悬液（100ul/孔），静置10min，使细胞稳定沉降。向下室加入趋化因子，移入37℃、5% CO 2培养箱培养。
2. 对于非贴壁细胞，迁移的细胞将落入下室培养基中。用镊子小心地取出 Transwell小室，并对底部室介质中的迁移细胞进行定量。
3. 对于贴壁细胞，小心取出小室，用棉签轻轻擦掉小室上端未迁移的细胞；将小室移入含有固定液的孔板内，室温孵育10-15min，将细胞固定在transwell膜的底侧。
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细胞侵袭实验
以直径 6.5 mm Transwell小室为例
侵袭实验 首先需要处理 Matrigel。Matrigel 对温度非常敏感，应按照相应产品说明书进行融化、稀释和包被。通常需要全程保持低温，使用预冷枪头、离心管及适宜的预冷稀释体系，防止 Matrigel 提前凝胶。
1. 向Transwell小室加入基质胶溶液，放入培养箱孵育，等待其凝固。向上室中加入细胞悬液，静置10min，下室加入迁移诱导剂，移入37℃、5% CO 2培养箱培养。
2. 对于非贴壁细胞，迁移的细胞将落入下室培养基中。用镊子小心地取出 Transwell小室，并对底部室介质中的迁移细胞进行定量。
3. 对于贴壁细胞，用棉签轻轻擦掉小室上端的基质胶和未迁移的细胞，将小室移入含有固定液的孔板内，室温孵育10-15min，将细胞固定在transwell膜的底侧。
4.染色方案A——结晶紫染色（贴壁细胞）
①. 将transwell小室放入含有结晶紫的孔中，室温孵育3-5min，
②. 移出小室，用PBS重复洗涤去除多余结晶紫。
③. 将小室置于室温干燥，切下膜，显微镜下观察定量，检测细胞迁移/侵袭能力。
5. 染色方案B——荧光染色--DAPI（贴壁细胞）
①. 避光环境下，将transwell小室放入含有DAPI的孔中，避光孵育10min，
②. 移出小室，用PBS重复洗涤去除多余染料。
③. 将小室置于荧光显微镜下观察定量，测细胞侵袭能力。
6. 非贴壁细胞的定量
通过 Transwell 膜孔迁移的非贴壁细胞将落入下室的培养基中。可以收集下室中的含细胞培养基进行定量。
使用血细胞计数器直接对培养基中迁移的细胞进行计数。迁移细胞总数=细胞/mL x 收集体积。如果细胞浓度较低，可将样品离心以浓缩细胞，然后将其重悬于较小体积的培养基中并使用血细胞计数或细胞计数仪进行计数。
✅️Transwell 孔径、接种细胞数量、孵育时间、血清梯度受细胞类型影响，需要预实验摸索条件。
✅️下层培养液务必紧贴 Transwell 膜，膜下不能留有气泡，保障趋化梯度正常形成。
✅️趋化因子种类与最佳使用浓度因细胞而异，建议预实验确定。
✅️细胞迁移孵育时长根据细胞类型调整。
✅️Matrigel 基质胶需置于 4℃/ 冰上保持液态，37℃会凝固；枪头、离心管和相关试剂应提前预冷。操作速度要快，但不能剧烈吹打。
✅️轻柔吸取 Matrigel 溶液加至 Transwell 膜表面，避免戳破损伤滤膜，使 Matrigel 在膜上形成均匀的薄层凝胶。
✅️加样过程中枪头切勿触碰 Transwell 滤膜与基质胶层，防止破坏凝胶结构，干扰实验结果。